一、目的要求 

1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培養基的配置原則和方法。 

3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。 二、基本原理 

    牛肉膏蛋白胨培養基： 

是一種應用**廣泛和**普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由于這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的**基本的營養物質，所以可供細菌生長繁殖之用。    高壓蒸汽滅菌： 

主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在一個密閉和加壓的滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰而產生蒸汽。待蒸汽將鍋內冷空氣從排氣閥中趨盡，關閉排氣閥繼續加熱。此時蒸汽不溢出，壓力增大，沸點升高，獲得高于100℃的溫度導致菌體蛋白凝固變性，而達到滅菌的目的。 

三、實驗材料 

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 

2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三

角瓶、培養皿、玻璃漏斗等。 

3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。 四、操作步驟 

（一）玻璃器皿的洗滌和包裝 1．玻璃器皿的洗滌 

玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。 

2．滅菌前玻璃器皿的包裝 

（1） 培養皿的包扎：培養皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養皿包

成一包，或者將幾套培養皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝后的培養皿須經滅菌之后才能使用。 

（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作

用是避免外界及口中雜菌進入管內，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約1~1.5cm。塞棉花時．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。 

先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管**放在長條報紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住**，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌。 （二）液體及固體培養基的配制過程 1．液體培養基配制 

     （1）稱量（假定配制1000ml培養基） 

按培養基配方比例依次準確地稱取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。 

（2）溶化 

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，**后補足所損失的水分。 

（3）調pH 

    調pH：一般用pH試紙測定培養基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養基偏酸或偏堿時，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進行調節。調節pH時，應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直**pH達7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進行調節。 

2．固體培養基的配制 

    配制固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加 

入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱**瓊脂全部融化，**后補足因蒸發而失去水分。 （三）培養基的分裝 

    根據不同需要，可將已配好培養基分裝入試管或三角瓶內，分裝時注意不要使培養基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，并將脫脂棉棄去。 1．試管的分裝 

取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養基直接流入試管內。裝入試管培養基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養基可分裝**試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養基分裝量為管高的1／3為宜。 2．三角瓶的分裝 

   用于振蕩培養微生物時，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養基；若用于制作 #p#分頁標題#e#

平板培養基用時，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。 （四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 

    為了培養好氣性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。 1．試管棉塞的制作 

制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。 

制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2／3在試管內，1／3在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。 

將裝好培養基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號筆注明培養基名稱及配制日期，滅菌待用。 2．三角瓶棉塞制作 

通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。 

在裝好培養基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。 （五）培養基的滅菌 

將上述培養基以0.103MPa，l21℃，20min高壓蒸氣滅菌。 滅菌過程： 

1. 加水：shou先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面沒過加熱蛇

管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發生燒干引起炸裂事故。 

2. 裝料：放回內層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸

汽流通而影響滅菌效果。裝有培養基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。 3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，擺正鍋蓋，

對齊螺口，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。 

4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內的冷空氣和水蒸汽一起從排

氣孔中排出。一般認為當排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。 

5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關閉排氣閥，繼續加熱，鍋內壓力開始上升。 6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時，控制電源，開始計時并維持壓力**所

需的時間。如本實驗中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。 

滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內的冷空氣必須完全排盡后，才能關閉排氣閥，維持所需壓力。 

7. 降壓：達到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力

表的壓力降**“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基或試劑由于內外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚**灼傷操作者。 （六）斜面和平板的制作 1．斜面的制作 

將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當斜度，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度l／2為宜。如制作半團體或固體深層培養基時，滅菌后則應垂直放置**凝固。 2．平板的制作 

將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養基融化后，待冷**50℃左右傾入無菌培養皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養基易于凝固而無法制作平板。 

平板的制作應在火旁進行，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養皿蓋打開一縫，**瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉平皿，使培養基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。 （七）培養基的滅菌檢查 

滅菌后的培養基，一般需進行無菌檢查。**好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養1~2天，確定無菌后方可使用。